T7体外快速转录试剂盒的使用事项涉及多个方面

　　T7体外快速转录试剂盒是一种基于T7 RNA聚合酶的高效RNA体外合成工具，通过优化转录反应条件，实现快速、高产量、高特异性的RNA合成，广泛应用于基因表达调控、RNA结构研究、RNA疫苗开发及核酸药物筛选等领域。该试剂盒利用T7 RNA聚合酶对T7启动子（TAATACGACTCACTATAGGG）的高度特异性识别，以含有该启动子的线性化质粒DNA、PCR产物或合成DNA片段为模板，在四种核苷三磷酸（NTP）底物存在下，从启动子下游开始合成与模板DNA一条链互补的RNA。

　　T7体外快速转录试剂盒的使用事项涉及模板准备、反应体系配置、操作注意事项及后续处理等关键环节，以下是具体说明：

　　一、模板准备

　　模板类型与要求

　　必须使用线性化DNA模板（如质粒经限制性内切酶切割或PCR产物），且模板上游需包含T7启动子序列（如TAATACGACTCACTATAGGG）。

　　模板下游建议避免3’突出末端，可通过T4 DNA聚合酶修平。

　　模板需纯净无RNase污染，建议通过胶回收纯化。

　　模板浓度

　　推荐用量为50 ng~1μg DNA（根据试剂盒说明书调整），过量可能导致非特异性转录。

　　二、反应体系配置

　　预配液与加样

　　使用试剂盒提供的2×T7转录预配液，需完q溶解结晶后摇匀使用。

　　典型20μL体系：模板DNA+10μL预配液+1μL T7酶+RNase-free水补足体积。

　　温度与时间控制

　　反应条件：37℃孵育1-2小时，延长时间不会提高产量。

　　终止反应：70℃加热10分钟灭活T7酶。

　　三、操作注意事项

　　防止RNA降解

　　全程使用RNase-free耗材（离心管、枪头等），避免手套污染。

　　可添加RNase抑制剂（如试剂盒未含）。

　　避免DNA污染

　　若需去除模板DNA，可加入RNase-free DNase I（37℃消化15-30分钟），随后用酚/氯仿抽提并乙醇沉淀纯化RNA。

　　特殊需求处理

　　加帽RNA：需自备加帽核苷酸类似物（如NEB产品）。

　　长片段RNA：选择优化型试剂盒（如T7 High Efficiency Kit），支持>6000 nt的转录。

　　四、产物检测与保存

　　检测方法

　　取1-3μL产物进行电泳验证长度和浓度，预期产量为1μg DNA生成5-10μg RNA。

　　分光光度计检测A260/A280比值（理想值≥1.8）。

　　保存条件

　　RNA可长期储存于-80℃，短期可放-20℃。

　　五、常见问题与解决

　　无RNA产物

　　检查模板是否线性化、启动子方向是否正确，或模板是否被RNase污染。

　　RNA产量低

　　优化模板质量（如胶回收纯化），避免模板过量或不足。

　　RNA长度异常

　　短于预期：检查模板是否含T7终止序列，可改用SP6启动子。

　　长于预期：可能因模板加尾功能或线性化不彻d。